中藻红蛋白的纯化 及其性质的研究 李邵蓉 林惠民 中国科学院水生生物研究所 , 武汉 提 要 从 中提取了藻红蛋 白 , 通过 改进纯化方法 , 得 到了三种电泳纯 的藻 红蛋 白 一型 藻红 蛋 白 , 一型 藻红蛋 白 和 卜型 藻红蛋 白以下简称 一 , , 一 和 。 分别测 定这三种 藻红蛋 白聚合体和 亚单位的分子量 。 测定 了它们的可见光的 吸收 光谱 和荧 光光谱 。 两种 一 的可见光的吸收光谱比 一 的多一个 的吸收峰 。 三 种藻红蛋 白的氨基酸组成以 酸性氨基酸和疏水性氨基酸为主 , 所 以 经等电聚焦测定的它们的 等电点都是偏酸性的 。 关键词 , 藻红蛋 白 藻红 蛋 白存在于 红 藻和 部分蓝 藻 、 隐藻中 , 是 一 种重 要 的 光合 色 素 。 在红藻 的 捕光色素系统 中 , 藻红 蛋 白最先捕获光能 , 首先传递给藻蓝 蛋 白 , 进而 递给别藻蓝蛋 白 , 最后 传 递给作用 中心 色 素 , 以 驱 动光合作 用 的 进行 。 另外 , 藻红蛋 白是一 种 天 然的 红 色素 , 它 的荧光 活性较高 , 近 年来它 被广泛地应用于 食 品 、 化工产 品和 荧 光免 疫技 术等方面 。 关于 藻红蛋 白的研究 , 目前国 内主 要 以大型 的海生红 藻为材料 , 而 国外的报道 中以单 细胞红 藻为材料 的也主要集 中在紫球藻属 口 柳 和蔷薇藻属 。 迄今 , 对 而 这一 属的藻红蛋 白的研究还 未曾见到报道 , 作者对 的 藻红 蛋白的 纯化及其性质进行探讨 。 材料与方法 生物材料和培养方法 本实验以 为材料 , 用 培养基川 进行培养 。 一级静置培养于 的三 角瓶内 一 周后 扩大至 的玻璃瓶内进行二级 培养 , 后全部倒人 有机玻 璃光生物反应器内进行半连续培养 , 培养条件均为 通 空气 起搅拌作用并补充 , 温 年月 日收到 水 生 生 物 学 报 卷 度 ℃ 左 右 , 光强 为 饮 , 连续光 照 。 当每毫升藻培养液中细胞个数达 个 时 , 用 离心法收获藻体 。 藻胆蛋白的分离与纯化步骤 取离心 收集 的藻体 湿 重 , 加人 蒸馏水 , 在一 ℃ 下反 复冻融三 至 四 次一 在冰浴 中用 超声波破 碎细 胞 进行高 速离心 , ℃ , 巧 取 上层 紫红 色 液体 进 行硫 按沉 淀 , 静 置 过夜 高速 离心 , ℃ , 留紫 色沉淀 物用 少量 蒸 馏水 溶解 用 蒸 馏水 充分透 析得粗藻红 蛋 白 检验 透析度 对 一 , 的缓冲液充分透 析 所 有缓 冲液 除特别表 明外 , 都含有 叠 氮钠 和 琉 基 乙 醇 上 一 纤维 素柱 , 用 一 , 的缓 冲 液充 分平衡 , 然后 用 、 和 的 溶液分步洗脱 , 收集 红色 带 将收集 的 红 色样 品对 一 , 缓 冲液充分透析 再通 过一次 同样 的 一 纤 维素柱 , 收集红色带 将 收集到的红 色样 品对磷 酸缓 冲液 , 充分透析 上 一 柱 , 收集 两条红 色 带 后 下 来 的 红 色 带为纯度较高 的一 种藻红 蛋 白 将先下 来的 红色带再通 过一 次 一 柱 再 次收集到 两条 红色带 , 为纯度较高的 另 外两种藻红 蛋 白 。 作者还采用 制备电泳的方法 , 分离纯化后两 种藻红蛋 白 。 光谱测定 将上 述分离纯化的三种 藻红 蛋白在室 温下 用 岛津 一 紫外分光光度计 狭缝 测定其吸收光谱 , 用 一 型 荧光分光光度计 狭缝 测定其荧光发射光谱 和荧光激发光谱 。 分子 的测定 利用 一 凝胶过滤柱 床体积 测定三 种藻红蛋 白多聚 体的分子 量 。 利用 凝胶 电泳测亚基分子 量 等电点测定 采用陈冬兰等 改进的聚丙烯酞胺凝胶等电聚焦方法 。 氨基酸分析 用 · 型 氨基酸 自动分析仪测定 。 结 果 藻红蛋 白的 分离和纯化 对前人所 用的藻红蛋 白分离提纯方法进行 了改进 , 得到了适合于 藻红蛋 白的分离提纯方法 , 经 过不 同的纯化步骤所得的纯度列于表 。 光谱特性 纯 化 后 的 三 种 藻 红 蛋 白 的 吸 收 光 谱 见 图 , 它 们 的 吸 收 高 峰 分 别 为 ! ∀ #∃ ! , 和 » 都是 56 3nm > 54 5n m > 49 8n m 。 由此推测:其 中¹ 是 b 一P E ; º 、 期 李邵蓉等 : R h 口 do so ru : m ar in us 中藻红蛋 白的纯化及其性质 的研究 259 » 分别为 B 一P E I 、 B 一P E Z 。 三 种藻红 蛋白的荧光发射峰都在 575n m 左右 (图 2) , 它们的 荧光激发光谱都是 三峰型 , 其 中 b 一P E 的荧光激发峰为 4 90 n m > 570 n m > 545 n m , B 一P E , 为 525nm > 562nm > 50Onm , B 一p E : 为 52 5n m > 562n m > 500n m 。 ( 图 3) 表 1 不 同纯化步界所得蔽红蛋白的纯度 Turify i ng step 纯 化 步 骤 P u rify i ng steP 粗提物 50 % 硫馁沉淀 第 一 次上 D E A E 52 纤维 素柱 第 二次上 D E A E 52 纤维 素柱 。 第一 条红色带 第一次上 B ‘o 一g e ‘p , 0 0 柱 { 第二条红色带(b 一 p E ) A 54 5 / A 28 。 、J 万 O户了OC ,今, ,U、J了乙们1 0, . .- … n1, 产 1乙4 咔j 4 第二次上 B ‘。一 g ·, p , 0 “‘ { 第一 条红 色带(B 一 P E) 第 二 条红色带(B 一 P E) 一 { B 一 P E 电 泳 提纯 { B 一 PE ao侧脚职 400 50 0 600 700 波 长( n m ) W avel ength 图 1 R . , ar in u : 二 种 藻红 蛋 白的 吸收光谱 F ig . l T h e ab so rPti 仍u s 1 . b 一P E ; 2 . B 一P E Z ; 3 . B 一 P E . 2. 3 分子t ¹ 根据 K av= 一bl g M 枕 (K a、 为分配 系数 , M 为分子量 , b 、 c 为常数)作出高分子量蛋 水 生 生 物 学 报 20 卷 120斗 -一 ~ 曰— ~+一一 三 ‘0 0 0 之祠。j石巴公妇su。 切40 ‘o吊。nu l灿界 , 0 妇 侧翻双似贫班 欲。>月拓1扮l-石三巴su。.从‘%侧卿职似友军 50 O 550 600 650 波长 ( n m ) W 台v e le n g th 70 0 40 0 4 50 5() 0 5 50 波 长 ( n m ) W a . k ngth 60 O 图 2 R . m a rin u: 三 种纯化 藻红蛋白的荧光发射光谱 F ig Z F l u oreseen ceem i ssi on s pe etra o f , t h re e P u r i fi e d P h y e o e ry t h r i n s fr o m R . m a r in us i n 0 . l m o l / L P h o s P h a te b u fe r ( P H 7 . 0 ) 1 . b 一P E ; 2 . B 一 P E 一; 3 . B 一P E Z 6 . 5 : 图 3 R . m ar 认us 三种纯化藻红蛋白的荧光激发光谱 F ig . 3 F l uo re袱 nceesexcitatipn spe c tra of three Purified Phycoery th rinsfrom R . mar认us i n 0 . lm o l / L P h o sP h a 比 b u fe r ( P H 7 . 0 ) 1 . B 一 P E 一; 2 . B 一 P E Z; 3 . 卜PE 层 5 · 5 望 翻 贫 翻 ; 十 卞 、 、、 C 4 . 仁 . 一 , 一 、 一一一 一一 0 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 5 0 . 6 0 . 7 0 . 8 0 . 9 1 分配 系数 K av 图 4 高分子 量 蛋 白质的标准曲线 (S eP h ad ex G 一 2 0 0 ) F ig . 4 T h e s t a n d a r d e u rv e o b ta i n e d b y u s i n g g e l fi lt r a ti o n o n s e p h a d e x G 一2 0 0 a . 甲状 腺球蛋白 ( T hy ro gl ob uli n ) :b . 铁 蛋白 (F erriti n ) e . 过氧化 氢酶 (C atal ase ) ; d . 醛缩酶 (^ ld ol ase ) e . 肌酸激酶 (M y oki n ase ) :仁细胞 色素丙 (C ytoeh rom e C ) 1 . B 一 P E 一: 2 . B 一 P E Z ; 3 · b 一P E 期 李邵蓉等 : R ho do sor us m ar in us 中藻红蛋 白的纯化及其性质 的研究 261 白质 的标准 曲线 (图 4) , 由此测 得 b 一P E 、 B 一P E I 和 B 一P E : 多 聚体 的分子 量依次 为: 42K D , 3 3 0 K D 和 280 K D 。 º 将小分子量标准蛋 白与三 种纯化 的藻红 蛋 白进 行 SD S一P A G E 分析 , 结果发现 , b 一P E 分成两条带 即 “ 和 吞亚基 , B 一P E 、 和 B 一P E : 均分成三 条带 , 即 “ 、 刀和 下亚基 。 根 据 lg M = a一b R f (M 为分子 量 , R : 为迁移率 , a 、 b 为常数)作标准 曲线 (图 5) , 测得 b 一P E 的 : , 方亚基分别 为 18K D , 2 4 K D : B 一p E I 的 : ‘ , 刀 ‘ 和 下 ‘ 亚基分别为 lo . SK D , 2 9 K D 和 22 K D
一p E : 的 : n, 方 n和 下 n 亚基分别为 10 . SK D , 2 4 K D 和 18K D 。 一 4. 常翻 亿 汉 余训冷 。 0 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 5 迁移 率 R f \ 图 5 低分子量蛋 白质标准 曲线 (SD s) F ig s T h e stand ard eu rv e ob tai ned by u si ng P o ly ac ry lam id e g el elec troP h oresi s w ith sod i um d od eeylsu lPhate ( 10 % ae仃lam ide ) a . 磷酸化酶 B (P h o sph o ryl ase B ) ;b . 牛血 清白蛋白( B o vi ne Se ru m A lbum i n ) : c · 肌红蛋 白(M y o gl obi n ) ;d · 碳酸醉酶 (c arb on i c anh yd rase ) ‘e · T M y 外壳蛋 白( T M v c ap sid ) 一 刀 ‘ 2 . 口和 刀 n 3 . 下 , 4 . : 和 下 n 5 . : ‘ 和 :n 2. 4 等电点 等 电聚焦 的结果 , 小分 子量的 藻红蛋 白 b 一P E 只 有一条红色带: PI 为 5 . 0 , 两个大分 子藻红蛋 白 B 一P E , 和 B 一P E : 均 出现两条红 色带 : PI 分别 为 5 . 0 和 , 6 . 1 8 。 大分子形式的 B 一P E 出现两个等电点 , 可能是聚胶过程 中发 生 了解聚的结果 。 2. 5 氨基酸组成 三种纯化的藻红 蛋白的氨基酸组成列 于表 2 。 其 中 酸 性 氨基 酸 (A sP + G lu) 占所 有 氨 基 酸 的 比 例 为 : b 一P E ( 21 . 8 % ) , B 一P EI ( 19 . 4 % ) , B 一p E Z ( 2 3 . 3 % ) : 碱 性 氨 基 酸 (Lys+A rg) 占所 有 氨 基 酸 的 比例 为 : b一p E ( 12 . 5 % ) , B 一P E I ( 12. 2 % ) , B 一P E : ( 12 . 7 % ) 。 而且三 种藻红蛋 白中除色氨酸待定外 , 其它 七种人体必需氨基酸都存在 。 水 生 生 物 学 报 20 卷 表 2 R . m 的三种旅红蛋 白的奴基酸组成 ( m g 八) TabZ A m ino aeid eom Position ofthreekind ofPhyeoerythrinsfrom R . m ar认us 氨基 酸 (A a) A m i no aeid b一 P E B 一 P E - B 一P E Z 、 哎、‘以0, j崎J 4 rD . … ,‘l、 o fO、了 Q飞砂矛 ‘.且.孟已人1胜. , 、0 j 0 11气‘. R 阿 . … 丈U峥l月, j‘ ,孟, 石,且盈 天冬 氨酸 (A sp ) 谷氨酸 (G l u ) 丝 氨酸 (S er ) 甘氨酸 (G ly) 组氨酸 (H i s ) 精氨酸 (A rg ) 苏氨酸 (T h r ) 丙氨酸 (A la) 脯氨酸 ( P ro ) 酪氨 酸 (T y r ) 撷 氨酸 (V al) 蛋氨酸 (M et) 胧氨酸 (C y s ) 异亮氨酸 ( Il e ) 亮氨酸 (L eu ) 苯丙氨酸 (P h e ) 赖 氨酸 (L v s ) 5 , 8 2 9 . 6 4 月 3 0 7 2 名 19 . 9 1 7 12 . 1 0 9 5 2 3 4 . 1 2 8 3 . 2 12 月 5 4 3 3 . 6 1 . 2 1 1 3 3 . 7 2 7 名 3 . 1 2 2 . 1 1 . 2 1 . 6 0 . 5 1 . 8 4 2 2 5 6 3 . 3 3 0 . 6 1 . 6 10 . 6 2 . 1 9 . 9 5 2 5 . 3 2 3 . 3 17 . 1 14 . 0 3 讨 论 本实验所采用 分离提纯 R . m ar in us 藻红蛋 白的方法是 在总结前人纯化方法 的基础 上加 以改进得到的 。 作者曾采用 马金石等16 介绍的经硫酸铁沉淀后 , 用 seP had ex G 一1 0 和 D E A E 一纤 维素进 行 4 次柱 层析 的方 法;和 程 凌 江等[71介 绍的经 硫酸钱结 晶后 , 用 Bi o 一ge l P 30 0 进行一次柱层析 的方法 , 发现用这两种方法只 能从 R . m ar l’n us 中提出 一种 藻红 蛋白 , 而且 其纯度很低 (A 545 / A 280 < 2 . 5) , 但作者从这两 种方法中受到启发 , 加以 改进后 得到本实验所采用 的方法 , 并认为这种方法对提取 R . m ar in us 中的 藻红蛋白非常 适用 。 从 R . m ar in us 中分离 出三种藻红蛋 白 b 一P E 、 B 一P E , 和 B 一P E Z 。 它 们的 吸收光谱相 似 , 都有 563n m 和 54 5n m 两 个主要 吸收峰 , 但两种 B 一P E 的吸 收光谱 中还有一个 498 nm 的 肩峰 (图 l) , 这是 B 一P E 和 b 一P E 的主 要不 同点 , 与 Po rP 抑 ridi um cr ue nt um 中的 B 一P E 和 b 一P E 的 吸收光谱类似 。 这三 种 PE 的吸 收峰位置 、 吸 收强 度上 的差 别均反 映了它 们 所含发色团 和 它们的不 同量 , 以 及 发色基 团所联结的蛋 白环 境不 同 。 5 6 3 n m 和 54 5n m 的吸收是 由与蛋 白以共价键相联结的藻红 胆 素引起的 , 4 9 8 n m 的吸收是由藻尿胆素引起 的 。 由图 2 可 见 , 三 种 藻红蛋 白的 荧光发射 光谱相 同 , 都 是单 峰型 , 最大 发射峰都在 期 李邵 蓉等 : R ho do sor us 阴ar in us 中藻红 蛋白的纯 化及其 性质的研究 263 57 5n m 。 而且它们的荧光激发光谱又都是三 峰型 (图 3) , 其中两种 B 一P E 的蜂型相 同 , 但 与 b 一P E 的峰型相差 较大 。 b 一P E 与两种 B一E 不 仅在吸 收光谱和 荧光光谱上有所不 同 , 而且他们的分子量和 亚基组成也相差很大 。 b 一P E 是只有两个亚基 ( : 、 用组成的低分子 量蛋 白质 (约 40 K D ) , 而两种 B 一P E 都是六 聚体 , 且有三 个亚基 ( : 、 刀 、 力组 成的 高分子量 蛋白质 (约 280 K D 和 3 30 K D ) 。 关于 R . m ar in us 藻红蛋 白的各种亚 基以及它们的化学结构还有待于进一步深 人研究 , 才能得到较确切 的结论 。 R . m ar in u : 的三种藻红 蛋 白的氨基酸组成有较大的共性 , 即它们所含的酸性氨基酸 总量大于碱性氨基 酸 , 因而 它们的等 电点都是偏酸性的 。 而 且三 种藻红 蛋 白中除色氨酸 待定外 , 其它七 种 人体必需 氨基酸都存在 。 表明这 三种藻红蛋 白都有较高的营养价值 , 为 其在 日常生活 中的应 用提供理论依据 。 综上 所述 , R . m ar in “: 的 b 一P E 与 B 一P E 有着既不 同又相 关 的关系 , 两 者在光合作用 中都起着吸 收光能的 作用 , 但它 们之 间的关系如何 , 至今还不 清楚 。 有人[8] 认为 b一P E 和 B 一P E 所含的 “ s ” 发色 团和 “ f’发色团的 比例不 同 , 也许 b一P E 起着聚集藻胆体结构 , 使其 最大效率地传递 能量 的作用 。 但也有人l9] 认为低分子量 的 b 一P 贬 可能是高分子量 B 一P E 的 解聚 产物 , 是藻体 中色 素蛋 白吸收 光 的功 能单位 。 关于 这些论点还有待于 进一 步证 实 。 参 考 文 献 【1 1 S tei n , R . J . , C u l t u r e M e t h o d s a n d G r o w t h M e a s u r e m e n t s . N e w y o k : t h e P r e s s S y n d i c a t e o f t h e U n i v e r s i t y o f C a m b r i d g e . 1 9 7 3 , 【2 ] 莽克强 、 徐乃 正 、 方荣祥编 , 聚丙烯酞胺凝胶 电泳 , 北京 :科学 出版社 , p p . 48 一54 1975 。 1 3] 赵永芳 , 生 物 化学 技术原理及 其应用 , 武汉 :武汉 大学 出版社 , p P: 48 一54 。 1 9 8 8 。 【4 ] 郭 尧君 , S D S 电 泳技术的实验考 虑及 最 新进 展 , 生物 化学及 生 物物理进展 19 9 1 , 1 8 ( l ) : 3 2 一37 。 【5] 陈冬兰 、 吴有 梅 , 聚丙烯酞胺凝胶等电聚胶测量蛋 白质等 电点 , 植物 生理通 讯 , 1 9 8 1 , 4: 48 一52 。 1 6] 马 金石 、 何 惠珠 、 瓶珍等 , 多管藻l劫召一藻红 蛋 白的分 离和结 构特征 , 科学通 报 , 1 9 8 1 , 4: 24 0 一242 。 [ 71 程凌江 、 将 丽 金 、 马金石 , 条斑紫菜 中R 一 藻红 蛋 白的 纯化及 : 和刀亚 基的分离 与发色团 含量的测定 , 海洋与湖沼
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